一、核心操作步驟  

準(zhǔn)備與配置  

環(huán)境準(zhǔn)備：操作前需在超凈臺(tái)或生物安全柜中完成，確保無菌環(huán)境；培養(yǎng)器具需提前消毒處理，避免微生物污染。  

培養(yǎng)基配置：按說明書比例混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑（如臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基需加入25mL添加劑至500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基），配制后置于2-8℃避光保存，2周內(nèi)使用完畢。若需添加生長(zhǎng)因子或激素（如胰島素、氫化可的松），需現(xiàn)用現(xiàn)加。  

細(xì)胞處理與接種  

細(xì)胞來源：凍存細(xì)胞需在37℃水浴快速解凍后，轉(zhuǎn)移至含無血清培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min棄上清，重懸后計(jì)數(shù)。  

接種密度：根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整（如間充質(zhì)干細(xì)胞P5前為10000cells/cm²，P16后為2000cells/cm²），接種時(shí)避免培養(yǎng)基直接沖擊培養(yǎng)瓶底面，防止“生長(zhǎng)空洞”。  

培養(yǎng)條件控制  

環(huán)境參數(shù)：置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，定期觀察細(xì)胞形態(tài)（如貼壁情況、增殖速度），每1-3天更換培養(yǎng)基以維持營養(yǎng)供給。  

動(dòng)態(tài)適應(yīng)：從有血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至無血清時(shí)，可采用“連續(xù)適應(yīng)法”（逐步提高無血清比例：25%→50%→75%→100%），或“直接馴化法”（高起始密度接種），需確保細(xì)胞活率＞90%。  

傳代與凍存  

傳代：細(xì)胞密度達(dá)80%-90%時(shí)，用胰酶消化（37℃消化2-6min，鏡檢觀察細(xì)胞回縮），加入含酶抑制劑的培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液后離心，按比例接種至新培養(yǎng)瓶。  

凍存：離心收集細(xì)胞后，加入無血清凍存液（如GMP級(jí)玻璃化凍存液），調(diào)整密度至1×10?-2.5×10?cells/mL，分裝至凍存管，經(jīng)程序降溫后轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存。  

二、無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基關(guān)鍵注意事項(xiàng)  

儲(chǔ)存與穩(wěn)定性  

未開封培養(yǎng)基需2-8℃避光保存，避免凍結(jié)；開封后分裝成小份（如5mL/管），-20℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白變性。  

光照（尤其是紫外線）會(huì)加速維生素、氨基酸等成分降解，需使用不透光容器或遮光包裝。  

質(zhì)量控制與監(jiān)測(cè)  

定期檢測(cè)細(xì)胞活力（臺(tái)盼藍(lán)染色）、純度（流式細(xì)胞術(shù)）及表型（如CD73、CD90表達(dá)），確保符合臨床或科研標(biāo)準(zhǔn)。  

觀察培養(yǎng)基狀態(tài)：若出現(xiàn)沉淀、渾濁或pH異常，需立即停用并排查污染源。  

適應(yīng)性與兼容性  

不同細(xì)胞類型需調(diào)整培養(yǎng)基配方（如間充質(zhì)干細(xì)胞需添加纖連蛋白促進(jìn)貼壁），轉(zhuǎn)換過程需逐步進(jìn)行，避免細(xì)胞應(yīng)激死亡。  

避免與含血清培養(yǎng)基混用，防止成分相互作用影響細(xì)胞特性。