dPCR（數(shù)字PCR）和qPCR（實時熒光定量PCR）是兩種在分子生物學(xué)研究中廣泛使用的核酸定量技術(shù)，它們之間存在一些顯著的區(qū)別。以下是對這兩種技術(shù)的詳細(xì)比較：

一、檢測原理

1. qPCR：

• 主要使用插入染料（如SYBR Green）或熒光探針（如TaqMan）來監(jiān)測整個擴增過程。

• 隨著PCR循環(huán)的進行，染料或探針的熒光強度逐漸增加，從而可以檢測到定量反應(yīng)的DNA。

• qPCR依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。

2. dPCR：

• 將一個樣本分成大量的微小反應(yīng)單元（通常是微滴或微孔），每個單元包含一個或多個拷貝的核酸分子。

• 每個單元都進行PCR擴增，并檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號強度。

• 根據(jù)泊松分布原理以及陽性反應(yīng)單元的比例，可以計算出起始模板DNA的濃度，因此dPCR是一種絕對定量的方法。

二、檢測流程

1. qPCR：

• 包括DNA提取、配置qPCR反應(yīng)體系、加入DNA模板、設(shè)置反應(yīng)條件及PCR擴增、讀取結(jié)果等步驟。

• 通常需要使用標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進行未知樣品的定量。

2. dPCR：

• 檢測流程與qPCR類似，但更強調(diào)樣本的精確分割和反應(yīng)單元的獨立性。

• 包括DNA提取、濃度檢測并稀釋、配置PCR反應(yīng)液、上機檢測、PCR擴增和結(jié)果判讀等步驟。

• dPCR的結(jié)果判讀通常依賴于對每個微小反應(yīng)單元的熒光信號檢測，以及基于泊松分布的統(tǒng)計分析。

三、技術(shù)優(yōu)勢與特點

1. qPCR：

• 具有高度的敏感性和特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)多重反應(yīng)和自動化檢測。

• 實時熒光檢測模式功能強大，具備定性、定量、突變檢測等多種功能。

• 技術(shù)成熟，有大量商業(yè)化產(chǎn)品可供選擇，且價格相對較低。

• 更適合高通量分析，動態(tài)范圍寬。

2. dPCR：

• 準(zhǔn)確度與精密度高，較少受到擴增效率的影響。

• 絕對定量，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接計算樣品中目的核酸分子的個數(shù)。

• 抗干擾能力強，對抑制劑的抵抗能力高，適用于復(fù)雜樣本的檢測。

• 在微小差異面前表現(xiàn)優(yōu)秀，能夠鑒別差異小于20%的拷貝數(shù)。

四、應(yīng)用場景

1. qPCR：

• 廣泛應(yīng)用于病原體檢測、基因表達分析、遺傳病診斷等領(lǐng)域。

• 在高通量篩選和大規(guī)模實驗中具有優(yōu)勢。

2. dPCR：

• 適用于需要高精度和高靈敏度的實驗，如稀有突變檢測、基因拷貝數(shù)變異分析、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）等。

• 在復(fù)雜樣本和抑制劑存在的情況下表現(xiàn)出色。

dPCR和qPCR在檢測原理、檢測流程、技術(shù)優(yōu)勢與應(yīng)用場景等方面存在顯著差異。研究人員應(yīng)根據(jù)實驗需求、樣本類型和實驗條件等因素，選擇合適的技術(shù)進行核酸定量研究。